Die offenen Fragen zur PCR-Detektion, DNA-Template-Qualität und RNA-Struktur bei IVT-mRNA ("modRNA") (1/4)

Die zentrale Problematik besteht aus mehreren miteinander verknüpften Unsicherheiten, die bei der Herstellung und Charakterisierung synthetischer mRNA berücksichtigt werden müssen. Sie betreffen nicht nur die Frage, welche Nukleinsäuren bei der Herstellung tatsächlich entstehen, sondern auch, ob die verwendeten analytischen Methoden diese unterschiedlichen Moleküle zuverlässig voneinander unterscheiden können und ob die letztlich erhaltene RNA überhaupt die strukturellen und funktionellen Eigenschaften besitzt, die aufgrund ihrer DNA-Ausgangssequenz erwartet werden.

Dabei müssen drei Ebenen getrennt betrachtet werden: erstens die Identität und Reinheit des DNA-Templates beziehungsweise der daraus gewonnenen Nukleinsäuren, zweitens die Genauigkeit der RNA-Synthese durch T7-RNA-Polymerase und mögliche IVT-Nebenprodukte und drittens die Frage, welche Sekundär- und Tertiärstrukturen unter Einbau modifizierter Nukleotide wie N1-Methylpseudouridin (m¹Ψ) tatsächlich entstehen.Das grundlegende Problem ist, dass eine bekannte DNA-Primärsequenz noch keine Garantie dafür darstellt, dass das daraus transkribierte RNA-Produkt eine einheitliche, sequenzgetreue und strukturell vorhersehbare Molekülpopulation bildet.

DNA-Template und PCR-Detektion: Was wird eigentlich gemessen?

Ein erster grundlegender Unsicherheitsfaktor betrifft die Identität der nachgewiesenen Nukleinsäuren. Wenn bei einer PCR- beziehungsweise RT-qPCR-Analyse ein bestimmtes Sequenzsignal festgestellt wird, ist zunächst entscheidend, ob tatsächlich DNA oder ursprünglich RNA nachgewiesen wurde, die erst im Rahmen der reversen Transkription in cDNA umgeschrieben worden ist.

Diese Unterscheidung ist insbesondere bei IVT-Systemen relevant, weil neben der gewünschten einzelsträngigen mRNA auch doppelsträngige RNA (dsRNA), verkürzte Transkripte, RNA:DNA-Hybride und weitere Transkriptionsprodukte entstehen können. Es ist deshalb nicht selbstverständlich, dass sämtliche beobachteten Nukleinsäuresignale ausschließlich dem vorgesehenen DNA-Template oder DNA-Verunreinigungen zugeordnet werden können.

Die Annahme, dass dsRNA bei einer In-vitro-Transkription nur eine vernachlässigbare Rolle spielt, ist mit der vorhandenen Literatur nicht vereinbar. Die EMA benennt dieses Problem ausdrücklich in ihrem Entwurf zur Qualitätssicherung von mRNA-Impfstoffen:

"Furthermore, double-stranded (ds) RNA can potentially be formed during in vitro transcription. Since dsRNA can be recognized by receptors of the innate immune system, their formation may lead to unwanted release of immune-stimulatory cytokines."

Darüber hinaus weist die EMA auf einen weiteren Aspekt hin:

"Incorporation of N1-methylpseudouridine may lead to +1 ribosomal frameshifting at ribosome slippery sequences which should be considered during characterisation."

EMA – Draft Guideline on the Quality Aspects of mRNA Vaccines

Wichtig ist dabei, dass es sich um einen Leitlinienentwurf handelt, der die relevanten Qualitäts- und Charakterisierungsanforderungen beschreibt, nicht um den Nachweis, dass jedes einzelne IVT-Produkt zwangsläufig dieselben Verunreinigungen enthält.

Auch Lenk et al. beschreiben in ihrem Review Understanding the Impact of In Vitro Transcription Byproducts and Contaminants, dass abhängig von den Reaktionsbedingungen und nachfolgenden Reinigungsschritten unterschiedliche Nebenprodukte entstehen können:

"But depending on the IVT conditions and subsequent purification steps, diverse byproducts such as dsRNA, abortive RNAs and RNA:DNA hybrids might form."

Die Autoren weisen darauf hin, dass diese Nebenprodukte gemeinsam mit der gewünschten mRNA in das Endprodukt gelangen und über zelluläre Pattern-Recognition-Rezeptoren unerwünschte Immunreaktionen auslösen können.

Lenk et al.– Understanding the Impact of In Vitro Transcription Byproducts and Contaminants

Eine weitere wichtige Arbeit ist die 2024 veröffentlichte Studie "Development of Biolayer Interferometry (BLI)-Based Double-Stranded RNA Detection Method with Application in mRNA-Based Therapeutics and Vaccines". Sie beschreibt dsRNA ausdrücklich als:

"a major impurity of IVT mRNA"

Besonders interessant ist hier die analytische Seite: Die Autoren zeigen, dass etablierte dsRNA-Nachweisverfahren wie ELISA und HTRF bei RNA mit modifizierten Uridinen eine verminderte Nachweisempfindlichkeit aufweisen können. Insbesondere m¹Ψ-modifizierte dsRNA kann dadurch unterschätzt werden. Die entwickelte BLI-Methode mit dem dsRNA-bindenden FHV-B2-Protein konnte dagegen auch unterschiedliche Uridinmodifikationen, kürzere dsRNA-Fragmente und Hairpin-Strukturen erfassen.

Damit wird deutlich, dass nicht nur die Entstehung von dsRNA ein Problem darstellt, sondern auch deren zuverlässige Quantifizierung. Ein negatives oder niedriges Messergebnis ist nicht automatisch gleichbedeutend mit einer Abwesenheit entsprechender RNA-Strukturen.

Development of BLI-Based Double-Stranded RNA Detection Method

Warum RT-qPCR hier zusätzliche Unsicherheiten erzeugt
Ein besonders kritischer Punkt ist die reverse Transkription.
Bei einer RT-qPCR wird RNA zunächst in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben. Erst diese cDNA wird anschließend mittels PCR amplifiziert. Das bedeutet: Ein PCR-Signal nach einer vorgeschalteten RT-Reaktion ist nicht automatisch ein Beleg dafür, dass die ursprüngliche Zielstruktur DNA war. Die Arbeit von Warncke und Knudsen "Detection Methods Targeting the Positive- and Negative-Sense RNA Transcripts from Plus-Stranded RNA Viruses" beschreibt ein damit verbundenes Problem: die sogenannte primerunabhängige beziehungsweise unspezifische Initiierung der reversen Transkription.

Die Autoren schreiben:

"These events could be caused by contaminating nucleic acids functioning as primers or self-priming due to RNA secondary structures."

Das bedeutet, dass RNA-Sekundärstrukturen selbst als Ausgangspunkt für die cDNA-Synthese dienen können. Eine RNA, die beispielsweise durch interne komplementäre Sequenzabschnitte eine Hairpin- oder andere doppelsträngige Region bildet, kann der reversen Transkriptase eine geeignete Ansatzstelle bieten. Besonders problematisch ist dies bei strang-spezifischen Nachweisen:

"the mere use of a strand-specific primer for reverse transcription is rarely sufficient."

Es können umgekehrt auch cDNA-Produkte entstehen, die fälschlicherweise einem bestimmten RNA-Strang zugeordnet werden. Die Studie beschreibt deshalb unter anderem sogenannte Tagged-RT-PCR-Verfahren, um solche falsch positiven Signale zu reduzieren.

Warncke & Knudsen– Detection Methods Targeting the Positive- and Negative-Sense RNA Transcripts

Damit ergibt sich eine wichtige analytische Unterscheidung:
Eine direkte PCR ohne vorherige reverse Transkription weist DNA nach. Eine RT-qPCR kann dagegen auch ursprünglich vorhandene RNA erfassen, nachdem diese in cDNA umgeschrieben wurde. dsRNA ist dabei ebenfalls RNA und kann grundsätzlich in die cDNA-Population eingehen.

Sekundärstrukturen können zusätzlich die reverse Transkription beeinflussen und bei bestimmten Versuchsdesigns zu unspezifischen oder strangfalsch zugeordneten Signalen führen. Daraus folgt nicht, dass jedes PCR-Signal durch dsRNA verursacht wird. Es folgt aber, dass ein Sequenzsignal allein nicht ausreicht, um die ursprüngliche chemische Identität des untersuchten Moleküls eindeutig festzustellen.

Ergänzend dazu muss Onchuru und Kaltenpoth erwähnt werden. Die Arbeit "Quantitative PCR Primer Design Affects Quantification of dsRNA-Mediated Gene Knockdown" untersucht einen weiteren analytischen Fehlerfaktor. Die Autoren zeigen, dass die Position der PCR-Primer entscheidend dafür sein kann, ob eine dsRNA-vermittelte Genstilllegung korrekt quantifiziert wird. Wenn die Primer innerhalb der Sequenzregion liegen, die auch dem eingesetzten dsRNA-Konstrukt entspricht, können die Ergebnisse insbesondere bei gering exprimierten Genen falsch-negative Aussagen über den Knockdown liefern.

Die offenen Fragen zur PCR-Detektion, DNA-Template-Qualität und RNA-Struktur bei IVT-mRNA ("modRNA") (2/4)

Sie kommen zu dem Schluss:

"quantifying the efficiency of dsRNA-mediated RNAi with primers amplifying sequences completely contained in the dsRNA target region should be avoided"

Dies ist zwar noch kein allgemeiner Nachweis, dass jede mitisolierte dsRNA bei einer RT-qPCR zwangsläufig zu falsch hohen Expressionswerten führt. Aber es zeigt sehrwohl, dass die Überlappung von Primerbindungsstellen und dsRNA-Zielsequenzen die Interpretation der Ergebnisse erheblich beeinflussen kann.

Onchuru & Kaltenpoth– Quantitative PCR Primer Design Affects Quantification of dsRNA-Mediated Gene Knockdown

Die eigentliche offene Frage lautet deshalb: Wie wurde bei der jeweiligen Untersuchung sichergestellt, dass ein detektiertes Nukleinsäuresignal tatsächlich aus DNA stammt und nicht aus RNA, die während der Probenaufbereitung oder reversen Transkription in ein amplifizierbares cDNA-Produkt überführt wurde? Dafür wären unter anderem getrennte Kontrollen mit und ohne Reverse Transkriptase, DNase- und RNase-Behandlungen sowie ein eigenständiger, ausreichend sensitiver dsRNA-Nachweis relevant. Die verschiedenen Nukleinsäureklassen müssen analytisch voneinander getrennt werden, bevor man aus einem PCR-Ergebnis auf die tatsächliche Zusammensetzung einer Probe schließen kann.

T7-RNA-Polymerase: Die Magnesiumkonzentration beeinflusst nicht nur die Ausbeute, sondern auch die Sequenztreue

Ein weiterer wesentlicher Unsicherheitsfaktor betrifft die Genauigkeit der RNA-Synthese selbst.

Die Arbeit "The Impact of Magnesium Ions on The Fidelity of T7 RNA Polymerases" untersucht den Einfluss unterschiedlicher Magnesiumkonzentrationen auf die Transkriptionsgenauigkeit von Wildtyp-T7-RNA-Polymerase und einer modifizierten PrimeCap-T7-Polymerase. Die Autoren verglichen nominelle Magnesiumkonzentrationen von 4, 8 und 12 mM und untersuchten anschließend die aus den RNA-Transkripten gewonnenen cDNA-Klone.

Die im Projekt hinterlegten Ergebnisse zeigen:

Bei 4 mM Magnesium wurden in der Wildtyp-Gruppe keine Sequenzveränderungen in den zehn untersuchten Klonen festgestellt. Bei der modifizierten Polymerase trat allerdings eine größere Deletion in einem Klon auf. Bei 8 mM enthielten sieben von zehn Wildtyp-Klonen und acht von zehn PrimeCap-Klonen Mutationen.

Bei 12 mM enthielten sämtliche untersuchten Klone beider Polymerasegruppen Mutationen. Die beobachteten Veränderungen umfassten Substitutionen, Insertionen und Deletionen. Die wesentliche Aussage ist damit, dass eine Erhöhung der Magnesiumkonzentration unter den untersuchten Bedingungen mit einer deutlich erhöhten Häufigkeit mutationshaltiger Transkripte verbunden war.

NCBI BioProject 1520612 – The Impact of Magnesium Ions on The Fidelity of T7 RNA Polymerases

Eine methodische Einschränkung ist allerdings wichtig: Es handelt sich bei dem verlinkten Datensatz um eine NCBI-BioProject-Dokumentation, nicht um einen vollständigen peer-reviewten Fachartikel. Zudem beruhen die genannten Vergleiche auf zehn Klonen je Gruppe. Die Ergebnisse sind daher ein relevanter Hinweis auf ein Qualitätsproblem, aber noch kein universeller Nachweis für jede T7-IVT-Reaktion.
Die Konsequenz für die Charakterisierung ist dennoch erheblich: Eine hohe RNA-Ausbeute ist nicht gleichbedeutend mit einer hohen RNA-Qualität. Selbst wenn die gewünschte Länge erreicht wird, kann die Sequenzintegrität durch fehlerhafte Nukleotidinkorporation beeinträchtigt sein.

Damit stellt sich die Frage, ob bei der Optimierung der IVT-Reaktion tatsächlich alle relevanten Qualitätsparameter gleichzeitig berücksichtigt wurden: RNA-Ausbeute, Sequenztreue, Fragmentlängen, dsRNA-Anteil und funktionelle Integrität. Darüber hinaus darf eine Untersuchung, die lediglich die Größe oder Menge der RNA bestimmt, nicht als ausreichender Nachweis einer korrekten RNA-Sequenz interpretiert werden.

N1-Methylpseudouridin: Die entscheidende Frage ist nicht nur der Einbau, sondern auch dessen Einfluss auf die RNA-Struktur

Besonders interessant wird die Problematik beim Einsatz von N1-Methylpseudouridin (m¹Ψ).

Hier müssen zunächst zwei grundsätzlich unterschiedliche biologische Vorgänge auseinandergehalten werden. In natürlichen eukaryotischen Zellen werden RNA-Modifikationen wie Pseudouridin (Ψ) durch spezielle Enzyme nach der Transkription eingebaut. Dazu gehören die Pseudouridinsynthasen (PUS), beispielsweise PUS1. Diese Enzyme erkennen bestimmte RNA-Sequenzen und RNA-Strukturen und modifizieren gezielt geeignete Uridinpositionen.

Bei synthetischer IVT-mRNA ist das Verfahren hingegen ein anderes: Hier wird m¹Ψ-Triphosphat (m¹ΨTP) bereits während der Transkription als Nukleotidbaustein angeboten und kann anstelle von UTP durch die T7-RNA-Polymerase in die RNA eingebaut werden. Das ist ein wesentlicher Unterschied. Die natürliche, enzymatisch gesteuerte und positionsspezifische Modifikation ist nicht mit dem weitgehend substratgesteuerten Einbau eines modifizierten Nukleotids während einer künstlichen In-vitro-Transkription gleichzusetzen.
Daraus ergibt sich die Frage, wie zuverlässig und gleichmäßig die modifizierten Nukleotide tatsächlich eingebaut werden und welche Konsequenzen das für die Faltung der entstehenden RNA hat.

Li et al. untersuchten in Chemical Pulldown Reveals Dynamic Pseudouridylation of the Mammalian Transcriptome die Häufigkeit von Pseudouridin in Säuger-mRNA.

Die Autoren ermittelten mittels quantitativer Massenspektrometrie ein Ψ/U-Verhältnis von ungefähr 0,2–0,6 %. Das ist insofern interessant, als Pseudouridin zwar eine sehr verbreitete RNA-Modifikation ist, seine Häufigkeit und Verteilung in mRNA aber nicht mit der in tRNA und rRNA gleichgesetzt werden können. Die Autoren entwickelten zudem ein chemisches Anreicherungsverfahren, CeU-Seq, und identifizierten zahlreiche potenzielle Pseudouridinpositionen in menschlichen Transkripten. Sie bestätigten allerdings nur einen Teil dieser Positionen biochemisch.

Li et al.– Chemical Pulldown Reveals Dynamic Pseudouridylation of the Mammalian Transcriptome

Eine ergänzende Arbeit ist Carlile et al. (2014), Pseudouridine Profiling Reveals Regulated mRNA Pseudouridylation in Yeast and Human Cells.
Die Autoren zeigten, dass Pseudouridylierung auch in mRNA vorkommt und durch Enzyme der PUS-Familie reguliert wird. Sie entwickelten mit Pseudo-seq eine Methode zur genomweiten Identifizierung solcher Modifikationen. Die Arbeit ist wichtig, weil sie zeigt, dass Pseudouridylierung kein zufälliger chemischer Vorgang ist, sondern in natürlichen Zellen reguliert und an bestimmte Positionen gebunden sein kann.

Carlile et al.– Pseudouridine Profiling Reveals Regulated mRNA Pseudouridylation in Yeast and Human Cells

Eine besonders relevante Ergänzung liefert die Arbeit "mRNA Structure Determines Modification by Pseudouridine Synthase 1". Die Autoren untersuchten, welche Eigenschaften einer RNA bestimmen, ob sie durch PUS1 pseudouridylisiert wird. Dabei zeigte sich, dass nicht nur die unmittelbare Nukleotidsequenz entscheidend ist. Vielmehr spielt die räumliche Anordnung der RNA eine zentrale Rolle. Sie identifizierten ein charakteristisches strukturelles Motiv, insbesondere eine Stem-Loop-Struktur, die für die Erkennung durch PUS1 wichtig ist.

Damit wird deutlich, dass die natürliche Modifikation von RNA nicht einfach durch das Vorhandensein eines bestimmten Uridins bestimmt wird. Die zugängliche RNA-Struktur und der Sequenzkontext beeinflussen, ob eine Modifikation überhaupt stattfinden kann.

mRNA Structure Determines Modification by Pseudouridine Synthase 1

Diese Erkenntnisse sind für synthetische mRNA relevant, weil sie zeigen, wie eng RNA-Modifikationen und RNA-Faltung miteinander verbunden sind. Sie dürfen allerdings nicht so interpretiert werden, als würde PUS1 den Einbau von m¹Ψ während einer T7-IVT-Reaktion steuern. Das sind unterschiedliche biochemische Prozesse.

Die offenen Fragen zur PCR-Detektion, DNA-Template-Qualität und RNA-Struktur bei IVT-mRNA ("modRNA") (3/4)

m1Ψ wird nicht notwendigerweise gleichmäßig eingebaut
Besonders wichtig ist in diesem Zusammenhang Fleming und Burrows: "Nanopore Sequencing for N1-Methylpseudouridine in RNA Reveals Sequence-Dependent Discrimination of the Modified Nucleotide Triphosphate During Transcription". Sie untersuchten mittels direkter Nanopore-RNA-Sequenzierung, wie sich UTP und m1ΨTP in unterschiedlichen Sequenzkontexten während der Transkription verhalten. Dabei zeigte sich eine ausgeprägte Sequenzkontextabhängigkeit bei der Diskriminierung der modifizierten Nukleotidtriphosphate durch die T7-RNA-Polymerase.

Das ist besonders relevant, weil es bedeutet, dass der Einbau von m1Ψ nicht allein durch die nominelle Konzentration des modifizierten Nukleotids in der Reaktionslösung bestimmt wird. Auch die umgebende Sequenz beeinflusst, wie die Polymerase das jeweilige Nukleotid verarbeitet. Die Autoren schreiben damit ein Problem fest, das über die bloße Frage hinausgeht, ob m¹Ψ grundsätzlich eingebaut werden kann: Entscheidend ist auch, ob der Einbau an unterschiedlichen Positionen und in unterschiedlichen Sequenzumgebungen gleichmäßig erfolgt.

Fleming & Burrows– Nanopore Sequencing for N1-Methylpseudouridine in RNA Reveals Sequence-Dependent Discrimination

Ergänzend dazu untersuchten Chen et al. (2022) in "N1-Methyl-Pseudouridine Is Incorporated with Higher Fidelity Than Pseudouridine in Synthetic RNAs" die Genauigkeit der Nukleotidinkorporation. Sie zeigten, dass m1Ψ im untersuchten System mit höherer Fidelity als Ψ eingebaut wurde. Gleichzeitig fanden sie Unterschiede zwischen den verwendeten RNA-Polymerasen und beobachteten verschiedene Fehlermuster. Eine wichtige methodische Einschränkung: Die Autoren analysierten die RNA über eine anschließende cDNA-Synthese und Sequenzierung. Die dabei beobachteten Fehler können deshalb sowohl aus der RNA-Polymerase als auch aus der reversen Transkriptase stammen.

Die Arbeit zeigt somit, dass die Wahl des modifizierten Nukleotids und der Polymerase die Synthesegenauigkeit beeinflusst. Sie belegt jedoch gerade nicht, dass jedes einzelne m1Ψ-Molekül in jedem Sequenzkontext fehlerfrei eingebaut wird.

Chen et al.– N1-Methyl-Pseudouridine Is Incorporated with Higher Fidelity Than Pseudouridine in Synthetic RNAs

Die RNA-Struktur: Aus einer bekannten Primärsequenz folgt keine eindeutig vorhersehbare Sekundär- oder Tertiärstruktur

An diesem Punkt liegt meines Erachtens eine der wichtigsten offenen Fragen der gesamten RNA-Problematik. Eine DNA-Sequenz definiert zunächst die Information, die bei der Transkription in eine RNA-Primärsequenz überführt werden soll. Daraus folgt jedoch nicht automatisch, dass die resultierende RNA eine einzige, eindeutig definierte räumliche Struktur annimmt.

RNA kann unterschiedliche strukturelle Ebenen ausbilden.

Primärstruktur: die lineare Nukleotidsequenz. Sekundärstruktur: lokale Basenpaarungen, beispielsweise Stem-Loops, Hairpins, interne Schleifen und weitere doppelsträngige Bereiche.

Tertiärstruktur: räumliche Wechselwirkungen zwischen weiter auseinanderliegenden RNA-Abschnitten, beispielsweise durch langreichweitige Kontakte, koaxiales Stapeln und komplexe Faltungswechselwirkungen.

Hinzu kommen dynamische Konformationszustände. Eine RNA muss nicht zu jedem Zeitpunkt in derselben Struktur vorliegen. Vielmehr können unterschiedliche Faltungszustände nebeneinander existieren oder abhängig von Temperatur, Ionenmilieu, Sequenzkontext und anderen Bedingungen ineinander übergehen.
Die bloße Kenntnis der DNA-Template-Sequenz reicht daher nicht aus, um die tatsächlich entstandene RNA-Struktur experimentell zu bestätigen.

Eine wichtige Grundlage hierfür liefert Mauger et al. (2019) mit der Arbeit "mRNA Structure Regulates Protein Expression Through Changes in Functional Half-Life". Die Autoren beobachteten den Zusammenhang zwischen mRNA-Primärsequenz, Sekundärstruktur und Proteinexpression. Sie verwendeten zwei Ansätze, um den Einfluss der Primärsequenz und der Sekundärstruktur voneinander zu trennen:

"Our work uses 2 approaches to disentangle the regulatory roles of mRNA primary sequence and secondary structure: global substitution with modified nucleotides and computational sequence design."

Ein besonders wichtiger Befund war, dass die Sekundärstruktur die funktionelle Halbwertszeit einer mRNA unabhängig von der Codonverwendung beeinflussen kann.

"secondary structure can increase mRNA half-life independent of codon usage."

Das bedeutet, dass nicht allein die kodierende Sequenz oder die Anzahl bestimmter Codons über die Eigenschaften einer mRNA entscheidet. Auch ihre Faltung beeinflusst Stabilität und Proteinexpression. Für die Charakterisierung synthetischer mRNA bedeutet das: Eine formal korrekte Primärsequenz ist noch kein Nachweis einer bestimmten funktionellen RNA-Struktur.

Mauger et al.– mRNA Structure Regulates Protein Expression Through Changes in Functional Half-Life

Eine weitere relevante Arbeit ist Fuchs Wightman et al. in "SEISMICgraph: A Web-Based Tool for RNA Structure Data Visualization". Hier ist wichtig, dass es sich nicht nur um eine Softwarepublikation handelt. Die Arbeit behandelt auch experimentelle RNA-Strukturdaten und deren Interpretation. Im Zusammenhang mit modifizierten Nukleotiden berichten die Autoren über strukturelle Veränderungen, die durch Ψ und m¹Ψ ausgelöst werden können.

Sie schreiben:

"Similar DMS patterns, indicative of structural rearrangements, were also observed in sequences modified with m1Ψ"

Und weiter:

"The differences are further suggested by the even more drastic structural changes seen upon incorporation of Ψ compared to m1Ψ."

Besonders interessant ist der Bezug zu Riboswitches. Die Autoren zeigen, dass Ψ und m1Ψ die strukturelle Umschaltung bestimmter Riboswitches beeinträchtigen können. Das ist ein wichtiger Hinweis darauf, dass eine chemische Veränderung einzelner Basen nicht nur die unmittelbaren Eigenschaften der jeweiligen Nukleotide betrifft, sondern auch die Faltungs- und Funktionsmöglichkeiten der gesamten RNA beeinflussen kann.

Die Verwendung modifizierter Nukleotide muss deshalb auch unter strukturellen Gesichtspunkten untersucht werden.

Fuchs Wightman et al.– SEISMICgraph: a web-based tool for RNA structure data visualization

Yadav et al. zeigen darüber hinaus, dass Modifizierte Basen sogar die Tertiärstruktur verändern. Die Autoren untersuchten den Einfluss chemisch modifizierter Basen, darunter m1Ψ und m5C, auf die Faltung einer synthetischen RNA-Origami-Struktur und eines natürlichen Ribozyms. Hierbei kamen unter anderem Kryo-Elektronenmikroskopie, FRET-Messungen und biochemische Funktionstests zum Einsatz. Die Ergebnisse zeigen, dass modifizierte Basen die Ausbildung bestimmter Tertiärstrukturen beeinflussen können. Dabei werden alternative Faltungszustände stabilisiert und strukturelle Reifungsprozesse beeinträchtigt.

Besonders relevant ist die Erkenntnis, dass diese Effekte nicht ausschließlich auf veränderten Basenpaarungen beruhen, sondern insbesondere auch durch Veränderungen der Basenstapelungsenergie entstehen. Die Autoren zeigen damit, dass Modifikationen wie m¹Ψ die räumliche Organisation einer RNA und deren funktionelle Eigenschaften beeinflussen können. Das ist ein wesentlicher Unterschied zur Vorstellung, dass die chemische Modifikation lediglich eine einzelne Base austauscht, ohne die übrige Struktur wesentlich zu beeinflussen.

Yadav et al.– Base Modifications Shift Tertiary Structure and Activity in Synthetic RNA Origami and a Natural Ribozyme

Gerade diese Arbeit unterstreicht, dass die strukturellen Konsequenzen modifizierter Nukleotide nicht ausschließlich anhand von Sequenzdaten oder computergestützten Vorhersagen beurteilt werden können. Sie müssen experimentell untersucht werden.
5. Was bedeutet das für die tatsächlich entstehende RNA?
Führt man die genannten Erkenntnisse zusammen, ergibt sich ein erhebliches Charakterisierungsproblem.

Wenn eine RNA anhand einer vorgegebenen DNA-Sequenz synthetisiert wird, sind mehrere voneinander unabhängige Prozesse zu berücksichtigen:

Die offenen Fragen zur PCR-Detektion, DNA-Template-Qualität und RNA-Struktur bei IVT-mRNA ("modRNA") (4/4)

1. Transkriptionsgenauigkeit: Die T7-Polymerase muss die vorgegebene Sequenz korrekt ablesen und die Nukleotide fehlerfrei inkorporieren. Magnesiumkonzentration und Nukleotidzusammensetzung können diese Genauigkeit beeinflussen.

2. Modifizierte Nukleotide: Bei Verwendung von m1ΨTP muss berücksichtigt werden, dass die Inkorporation sequenzkontextabhängig sein kann. Eine gleichmäßige Modifikation sämtlicher vorgesehener Positionen darf nicht einfach vorausgesetzt werden.

3. Sekundärstruktur: Die entstehende RNA kann lokale komplementäre Bereiche, Hairpins, Stem-Loops und andere strukturelle Elemente ausbilden. Diese können wiederum die reverse Transkription und die analytische Erfassung beeinflussen.

4. Tertiärstruktur: Die räumliche Organisation der RNA kann durch die Modifikationen verändert werden. Dabei können alternative Faltungszustände entstehen, die sich nicht allein aus einer Primärsequenzvorhersage ableiten lassen.

5. Nebenprodukte: Zusätzlich können dsRNA, verkürzte Transkripte und RNA:DNA-Hybride entstehen, deren Anteil von den IVT-Bedingungen und den Reinigungsschritten abhängt.

6. Analytische Identität: Eine Sequenzanalyse, die auf revers transkribierter RNA basiert, muss zwischen ursprünglicher DNA, regulärer RNA und RNA-abgeleiteten cDNA-Produkten unterscheiden können.

Damit stellt sich eine grundsätzliche Frage: Was wurde tatsächlich charakterisiert – die vorgesehene DNA-Sequenz, die daraus synthetisierte RNA-Primärsequenz oder die chemische und strukturelle Beschaffenheit des fertigen RNA-Produkts? Das sind drei unterschiedliche Untersuchungsebenen.

Eine Sequenzanalyse kann beispielsweise eine korrekte Primärsequenz bestätigen, ohne damit nachzuweisen, dass die RNA eine bestimmte Sekundär- oder Tertiärstruktur besitzt. Umgekehrt kann eine RNA eine erwartete Länge aufweisen, obwohl sie strukturell heterogen ist oder einen relevanten Anteil an Nebenprodukten enthält.

Für eine belastbare Charakterisierung wären deshalb unterschiedliche, aufeinander abgestimmte Verfahren erforderlich: Sequenzanalysen zur Prüfung der Primärstruktur, direkte RNA-Sequenzierung zur Untersuchung der Nukleotidzusammensetzung und Modifikationen, chemische Struktursondierung wie DMS-MaPseq oder SHAPE sowie eigenständige dsRNA-Nachweisverfahren. Insbesondere muss zwischen einer computergestützten Strukturvorhersage und einer experimentell nachgewiesenen RNA-Struktur unterschieden werden.

Zusammenfassung soweit: Die eigentlichen offenen Fragen

Aus den genannten Arbeiten ergeben sich letztlich vier zentrale Problemkomplexe.

Erstens: Die Identität der nachgewiesenen Nukleinsäuren.
Wenn DNA- beziehungsweise PCR-Signale festgestellt werden, muss nachvollziehbar sein, ob es sich tatsächlich um DNA handelt oder ob RNA über die reverse Transkription in die analysierte cDNA-Population gelangt ist. Insbesondere dsRNA und RNA-Sekundärstrukturen können die Interpretation bestimmter RT-PCR-Verfahren erschweren.
Zweitens: Die Qualität des DNA-Templates und die Genauigkeit der Transkription. Ein korrekt konstruiertes DNA-Template garantiert keine fehlerfreie RNA-Synthese. Die Ergebnisse zur Magnesiumabhängigkeit der T7-Polymerase zeigen, dass die Reaktionsbedingungen die Sequenztreue erheblich beeinflussen können. Hinzu kommen potenzielle IVT-Nebenprodukte, deren Entstehung und Entfernung gesondert untersucht werden müssen.
Drittens: Die tatsächliche Inkorporation von m1Ψ.

Die natürliche Pseudouridylierung ist ein regulierter, enzymatischer und positionsabhängiger Vorgang. Bei der synthetischen IVT wird m1Ψ dagegen bereits während der Transkription als modifiziertes Nukleotidtriphosphat angeboten. Die Untersuchungen von Fleming und Burrows zeigen, dass dessen Einbau sequenzkontextabhängig ist. Es muss daher experimentell geklärt werden, in welchem Umfang und mit welcher Verteilung die Modifikation tatsächlich vorliegt.
Viertens: Die strukturelle Integrität der fertigen RNA.

Eine bekannte Primärsequenz ist kein Beweis für eine bestimmte Sekundär- oder Tertiärstruktur. Die Arbeiten von Mauger, Fuchs Wightman und Yadav zeigen, dass RNA-Struktur funktionell relevant ist und dass chemische Basenmodifikationen strukturelle Eigenschaften und biologische Aktivitäten verändern können.

Das bedeutet, dass die tatsächliche Struktur einer modifizierten synthetischen RNA nicht einfach aus ihrer DNA-Ausgangssequenz abgeleitet werden kann.

Die entscheidende Schlussfolgerung

Das eigentliche Problem ist nicht, dass die genannten Studien zwangsläufig beweisen würden, dass ein bestimmtes RNA-Produkt fehlerhaft ist. Sie zeigen vielmehr, dass mehrere Voraussetzungen, die bei einer vereinfachten Betrachtung als selbstverständlich erscheinen könnten, experimentell überprüft werden müssen.

Insbesondere ist es problematisch, aus einer erfolgreichen PCR-Detektion, einer bestätigten DNA-Primärsequenz oder einer bestimmten RNA-Länge unmittelbar auf die chemische Identität, Sequenztreue und strukturelle Integrität des fertigen RNA-Produkts zu schließen.

Die zentrale Frage lautet deshalb:

Wo ist der experimentelle Nachweis, dass das tatsächlich entstandene RNA-Produkt hinsichtlich seiner Primärsequenz, Nukleotidmodifikationen, Sekundär- und Tertiärstruktur sowie seiner Nebenproduktzusammensetzung dem ursprünglich vorgesehenen Design entspricht?

Und damit verbunden:

Wie wurde ausgeschlossen, dass die verwendeten analytischen Verfahren RNA-abgeleitete cDNA, dsRNA und DNA-Verunreinigungen nicht ausreichend voneinander unterscheiden und dadurch ein unvollständiges oder irreführendes Bild der tatsächlichen Probenzusammensetzung erzeugen?

Die Literatur liefert für diese Fragen bereits zahlreiche konkrete Hinweise auf mögliche Fehlerquellen. Sie liefert jedoch keinerlei zuverlässige Daten zu den Produkten. Genau deshalb ist eine nachvollziehbare, unabhängige und methodisch ausreichend differenzierte Charakterisierung so wichtig.

Gerade bei modifizierter IVT-mRNA müssen diese Ebenen getrennt untersucht werden. Die angeführten Arbeiten machen deutlich, dass sowohl die Herstellung als auch die analytische Charakterisierung wesentlich komplexer sind, als es eine reine PCR- oder Sequenzbestätigung vermuten lässt.

Und man bemerke: Dies sind nur die Problem bei der IVT als solche. Nicht die, die sich bei der Nanopräzipitation zusätzlich summieren.

"A retrospective cohort study utilizing the TriNetX Global Collaborative Network (180 + million records). Adults without prior tinnitus or hearing loss were grouped by exposure: COVID-19 infection, mRNA vaccination, viral vector vaccination, and unexposed controls. Outcomes included tinnitus (ICD-10-CM: H93.1) and hearing loss (ICD-10-CM: H90) within six months post-index. Propensity score matching controlled for confounding and odds ratios (ORs) were calculated."

"Tinnitus
Among adults with documented COVID-19 infection, the odds of developing tinnitus did not differ significantly from uninfected and unvaccinated controls (OR 1.022, 95% CI: 0.997–1.048; RD 0.013%, p = 0.0818). Similarly, no significant differences observed when comparing infected individuals with those unvaccinated for mRNA COVID-19 vaccines (OR 1.001: 95% CI 0.977–1.025; RD 0.001%, p = 0.9437) and viral vector COVID-19 vaccines (OR 0.988: 95% CI 0.965–1.012; RD -0.007%, p = 0.3408).

mRNA COVID-19 vaccination was associated with significantly higher odds of tinnitus compared to individuals with no history of infection or mRNA COVID-19 vaccination (OR 1.220: 95% CI 1.189–1.252; RD = 0.143%, p < 0.0001). Viral vector COVID-19 vaccination showed a similar association (OR 1.269: 95% CI 1.114–1.447; RD 0.150%, p = 0.0003)."

"Hearing loss
An observed association was noted between COVID-19 infection and lower recorded odds of hearing loss diagnoses compared with individuals with no history of mRNA or viral vector COVID-19 vaccination (OR 0.930, 95% CI: 0.911–0.950; RD -0.062%, p < 0.0001). This association remained significant when comparing infected patients with mRNA-unvaccinated and viral vector unvaccinated comparators (OR 0.911, 95% CI: 0.893–0.93; RD -0.080%, p < 0.0001).

Conversely, mRNA COVID-19 vaccination was associated with higher odds of hearing loss compared with mRNA unvaccinated individuals (OR 1.214: 95% CI 1.189–1.240; RD 0.215%, p < 0.0001), while viral vector COVID-19 vaccination did not reach statistical significance (OR 1.095: 95% CI 0.983–1.220; RD 0.083, p = 0.1002).

Direct comparison shows higher odds of hearing loss following infection than after mRNA COVID-19 vaccination (OR 1.313: 95% CI 1.285–1.343; RD 0.219%, p < 0.0001) but lower odds compared to viral vector COVID-19 vaccination (OR 0.873: 95% CI 0.786–0.969; RD -0.114%, p = 0.0110)."

https://link.springer.com/article/10.1007/s00405-026-10512-5

5. Corona Symposium - Tag 1

https://www.youtube.com/watch?v=Z3u9ULaiNmg

5. Corona Symposium - Tag 2

https://www.youtube.com/watch?v=r3xAWucI8Uo

Aus dem ersten Tag des Symposiums 2026

Markus Krall liefert echten Denkstoff.

Translated from Japanese
2026.11.5 Sanseito, Mana Iwamoto
Pfizer’s COVID vaccine uses a substance called ALC-0315 in its lipid nanoparticles.
Basic research has raised concerns about its cytotoxicity, hasn’t it?

Ministry of Health, Labour and Welfare:
We have confirmed the toxicity tests, but we can’t disclose the details because they are trade secrets.

Comment:
The public is being given COVID vaccine ingredients under secret agreements with companies.

https://x.com/fseiichizb4/status/2119457625721192874

Aber, aber es ist eine Frau, die Bundespräsidentin wird.

Sind wir nicht fortschrittlich?

t.me/Rosenbusch

Ilse Aigner hat mitgemacht.

https://nius.de/politik/ilse-aigner-verglich-corona-leugner-mit-den-anfaengen-des-nationalsozialismus

t.me/Rosenbusch

https://www.youtube.com/watch?v=qlJ1c1v0l2k

MUST HAVE SEEN! Jun Ueda ist für mich insbesonders interessant.

„Es reichelt“ - Franz Becchi mit einem lesenswerten Kommentar zum Auftritt von Julian Reichelt bei Ben Ungeskripted:

https://0nlyfranz.substack.com/p/es-reichelt

„‚Bei mir im Büro und zu Hause, ich hab sie alle gehabt, und keiner hat sich an die Regeln gehalten’, sagt der Nius-Gründer über die politischen Entscheider der Corona-Zeit. Damals war er Chefredakteur der Bild. Reichelt will damit die Heuchelei der Politik entlarven. Was er dabei nicht zu merken scheint: Er entlarvt auch sich selbst. Denn wer die Regelbrecher bei sich zu Hause bewirtet, berichtet offenbar nicht über sie.“

„Was bleibt also nach dreieinhalb Stunden? Ein ehemaliger Chefredakteur, der die Mächtigen bei sich zu Hause bewirtete, während seine Zeitung über sie urteilte. Der von ihren Regelbrüchen wusste, aber offenbar nicht darüber berichtete. Und der heute als Enthüller auftritt – ohne Namen, ohne Belege, mit einem Buch, das irgendwann erscheinen soll.

Reichelt wollte zeigen, wie nah sich Politik und Journalismus damals waren. Das ist ihm gelungen, nur anders, als er dachte.“

t.me/ayawasgeht

https://www.youtube.com/watch?v=pdDi9UAyINg

LOOL! Ich weiß bereits jetzt schon womit Kremer argumentieren wird:

Liposome = Mizelle = LNPs. (Weil er von nichts ne Ahnung hat.)

Vergleich Onpattro. (Unzulässig weil a) anderer Verabreichungsweg, b) andere Payload c) andere Lipidkomposition, d) Vorbehandlung mit intravenösem Kortikosteroid, oralem Paracetamol, intravenösem H1-Blocker, intravenösem H2-Blocker)

Biodistribution, Verteilung, Blutpersistenz, Gewebepersistenz, und Transfektion + Zellpersistenz vermengt und nicht begriffen.

Schritte bis zum endosomalen Escape nicht verstanden.

Lipidaddukte und Lipidstereoisomere nicht begriffen.

Softmatterphysik ist was zum Naschen.

Vroman-Konstante und Henderson-Hasselbalch ignorieren.

Transkriptomik und Proteomik ignorieren.

Keinerlei Vorstellung davon, wie Zellbiologie und Systembiologie funktioniert, etc...