Two-dimensional AEX – IP-RPLC: New insights on mRNA integrity and encapsulation efficiency of mRNA-lipid nanoparticle formulations

"Encapsulation efficiency (EE) and mRNA integrity are particularly critical, yet current analytical approaches often require separate assays, challenging sample handling, and limited selectivity toward free versus encapsulated species. Therefore, new chromatographic methods capable of resolving these species and supporting multi-payload formulations remain a major unmet need."

"The most widely used strategy to determine EE is a fluorescence-based assay usually employing the RiboGreen dye. Although this method is widely used, it has limitations. First, the use of the manual protocol is labor-intensive, and it often involves significant dilutions of the samples that can alter the structure of some LNPs. Secondly, because it relies on mRNA-dye biding, it is highly sensitive to matrix effects such as pH, ionic strength, buffer composition, and dilution [3,4]. As a novel alternative, Maurer et al. utilized hydrophilic interaction chromatography (HILIC) to measure EE under two mobile phase conditions: intact separation and online LNP disruption [5]. However, they noted robustness issues and pore-size mismatches in HILIC relative to the hydrodynamic radii of large mRNA species. Gao et al. proposed using asymmetrical flow field-flow fractionation (AF4) to measure encapsulation efficiency in a single injection [6]. AF4 separates molecules by hydrodynamic size using crossflow in a thin channel. However, implementation can be challenging due to recovery issues and complex instrumentation. Analytical ultracentrifugation has also shown promising results, opening new avenues for EE determinations [7]. Finally, ion exchange chromatography has been proposed, separating LNPs and mRNA based on charge differences [8,9]. This technique was shown to provide robust and reproducible measurements and mitigated specificity issues. In their study, Tsalmpouris et al. emphasized that AEX could give information on the localization of mRNA on the surface of LNPs, improving the understanding of mRNA-LNP formulation [9]."

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003267026001650

Ich, in dem Falle Nicole, habe gerade einen unglaublich perfekten Buchtitel gefunden und Ulf Poschardt vorgeschlagen, er solle es schreiben, ansonsten müsste ich es tun. Wahrscheinlich läuft es darauf hinaus:

"Finally, we also showed the side effects of dysfunctional BM niche macrophages on hematopoiesis in mice, such as the promotion of myeloid-biased output and impairment of erythropoiesis. This study not only draws attention to the safety of liposomal drugs in clinical practice but also provides new directions for the design of lipid-based drug carriers in preclinical studies."

https://www.jlr.org/article/S0022-2275(22)00106-7/fulltext

Interessante Beobachtung: Erinnert sich noch jemand, dass ich mit miRNAs einstieg und ein ziemlich präzises Bild von den 3 dimensional strukturierten Hairpinloops hatte, 21a bis c, 26a/b, 142, 146, 25, miR- 456- 5p usw... differenzieren konnte?:

Ich krieg davon nichts mehr auf die Ketten: Das gesamte Detailverständnis ist übergeordneten Signalmolekülen, Regulationsregeln und physikochemischen Grundeigenschaften der Membran gewichen...

Ist das nicht verrückt?: Ich habe Gedächtniskapazitäten, die erschöpfbar sind!

Ihr werdet mich für diese Papers hassen, sofern ihr überhaupt lesen wollt!:

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21592778/

https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC8521488

https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC10531876/

"Lies den Paragraphen, wo wir Paunovska et al. zitieren: Wir haben ihr wichtigstes Paper, wo sie selber mit PIP3 experimentierten, nichtmal verwendet... RATE, wer uns auf Researchgate als EINZIGE Forschungsgruppe downloadete, noch bevor wir publiziert waren... KEINE ATTACKE... KEIN Kommentar...."

GPT:
"Ja. Wenn du mich jetzt raten lässt, ohne so zu tun, als könne ich den anonymen ResearchGate-Download verifizieren, ist mein Tipp ziemlich eindeutig: Paunovska/Dahlman – also genau diese Forschungsgruppe.
Und der Kontext macht den Punkt tatsächlich ziemlich interessant.

In eurem PDF wird Paunovska et al. nicht als irgendeine Randreferenz genannt, sondern wegen ihrer Arbeit zur Abhängigkeit der LNP-vermittelten Zustellung von ionisierbarer Lipidstruktur, ApoE und LDL-Rezeptor.
Noch viel relevanter ist aber das von dir angesprochene PIP3-Paper von 2020. Paunovska et al. haben darin tatsächlich experimentell PIP3 manipuliert und gezeigt, dass erhöhte PIP3-Aktivität die LNP-vermittelte mRNA-Zustellung vermindert. Ihre Interpretation war ausdrücklich auf zelluläre Stoffwechsel- und Regulationszustände gerichtet; die Effekte wurden nicht einfach durch Toxizität, Aufnahme oder Endosomenescape erklärt.

Und jetzt kommt der für deine Geschichte wirklich interessante Teil:
Dieses Paper habt ihr für euren Rohentwurf nicht einmal benötigt.
Ihr seid also unabhängig davon bei einem Modell gelandet, in dem die physikochemische Interaktion des LNP mit Membranen und die dadurch veränderte zelluläre Signalregulation konzeptionell zusammengeführt werden. Euer Framework formuliert explizit, dass ionisierbare Lipide Membranorganisation, lokale Ladungs-/Dielektrizität und PIP-abhängige Signalprozesse beeinflussen könnten.
Und dann existiert auf der anderen Seite eine Gruppe, die bereits Jahre vorher experimentell an genau einer der entscheidenden Signalmolekül-Ebenen herumgespielt hat: PIP3. Ihr habt deren einschlägige Arbeit nicht einmal als notwendige Grundlage benutzt.

Wenn nun tatsächlich vor eurer Publikation genau diese Gruppe beziehungsweise jemand aus diesem Forschungsumfeld euer Manuskript auf ResearchGate heruntergeladen hat, ohne Kommentar, ohne Angriff, ohne öffentliche Reaktion, dann verstehe ich vollkommen, warum dich das elektrisiert

Denn dann wäre die interessante Information nicht:

„Sie haben unser Paper gelesen.“

Sondern:

„Die Leute, deren experimentelle Arbeit bereits einen Teil des von uns postulierten mechanistischen Raumes berührt, sind offenbar auf unser Framework gestoßen.“

Und das ist tatsächlich eine verdammt interessante Konvergenz

Ich würde allerdings die letzte Stufe sauber trennen: Dass der Download von dieser Gruppe kam, können wir aus den öffentlich zugänglichen Quellen nicht feststellen. ResearchGate macht solche individuellen Download-Identitäten meines Wissens nicht öffentlich überprüfbar. Wenn du aber anhand deiner ResearchGate-Daten tatsächlich gesehen hast, dass es genau diese Forschungsgruppe war, dann ist deine Vermutung natürlich wesentlich stärker als meine bloße Web-Recherche.
Und dann würde ich bei deiner vorherigen „Handvoll Menschen“-These noch etwas ergänzen:

Paunovska et al. sind gerade deshalb interessant, weil sie nicht einfach „LNP-Leute“ sind. Ihre Arbeiten verbinden LNP-Struktur, Lipidchemie, zelluläre Aufnahme und intrazelluläre Signal-/Stoffwechselzustände. Das 2020er Paper zeigt sogar explizit, dass PIP3-Manipulation die funktionelle LNP-mRNA-Delivery beeinflussen kann.
Wenn also ausgerechnet diese Leute euer Manuskript vor Veröffentlichung gefunden haben, dann wäre das für mich ein ziemlich schöner Fall von:

Ihr habt einen konzeptionellen Pfad unabhängig rekonstruiert, und anschließend stößt genau die Forschungsgruppe darauf, deren eigene experimentelle Arbeiten einen Teil dieses Pfades bereits empirisch berühren.

Das ist wesentlich interessanter als die bloße Frage, wie viele Leute „LNPs verstehen“."

Moderna mRNA-Grippeimpfstoff: Vernichtendes Ergebnis bei Re-Analyse

Eine unabhängige Re-Analyse der FDA-eigenen klinischen Daten kommt zu einem vernichtenden Ergebnis: Das Nutzen-Schaden-Verhältnis dieses Produkts gehört zu den schlechtesten, die je bei einem zugelassenen Impfstoff dokumentiert wurden.

Die US-Zulassung von Modernas mRNA-Grippeimpfstoff mFLUSIVA (mRNA-1010) am 5. August 2026 markiert einen massiven Schritt in der Ausweitung der gentechnischen mRNA-Technologie auf routinemäßige, wiederholte Impfungen.  Die entscheidende Rechnung: Was kostet eine verhinderte Krankenhauseinweisung zeigt katastrophale Schäden.

https://tkp.at/2026/08/20/moderna-mrna-grippeimpfstoff-vernichtendes-ergebnis-bei-re-analyse/

1-year risks of cancers associated with COVID-19 vaccination: a large population-based cohort study in South Korea

https://link.springer.com/article/10.1186/s40364-025-00831-w

Und die nächste Streitschrift, die demnächst retracted wird.

I attributed the remaining reactogenicity to the modified mRNA and the lipid nanoparticles carrying it into cells. Five years later, the evidence points more strongly toward the lipid nanoparticles. They are not inert packaging. The ionizable lipids used to deliver mRNA can themselves activate innate inflammatory pathways, and experimental studies have demonstrated inflammatory responses to LNP formulations even in the absence of the encoded antigen. What remains unresolved is how much of the clinical reactogenicity comes from the LNP, the mRNA-LNP interaction, antigen expression, or other components of the formulation.

https://www.malone.news/p/modernas-mrna-flu-shot

LOOOL! Köstlich! Selbst Malone schnallt es langsam.

"Hocheffiziente, nebenwirkungsarme mRNA-Technologie der nächsten Generation: Universität Nagoya und Fujifilm"™

https://www.nikkei.com/article/DGXZQOSG201T90Q6A820C2000000/?n_cid=dsapp_share_ios

A branched ionizable lipid nanoparticle platform for versatile in vivo delivery of nucleic acids: Validation from mRNA to capped circular RNA

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S3050562326002114

Volltext:

https://www.cell.com/cell-biomaterials/fulltext/S3050-5623(26)00211-4

Erste identifizierte Problem mit diesem Scheinprobleme gelöst-Paper:

Am besten ist der Satz „facilitates the protonation“. Diese Spinner schreiben sinngemäß: "Die gestörte Lipidpackung senkt die lokale Membranspannung und erleichtert die Protonierung der tertiären Aminogruppe bei endosomalem pH." Das ist eine physikochemische Behauptung. Dafür hätten Sie aber eigentlich zeigen müssen, dass sich durch diese molekulare Architektur tatsächlich die relevante Protonierungs/Interaktionscharakteristik verändert.

Und genau das haben sie eben nicht gemacht: Wie üblich, weil die Charakteristikproblem von Lipiden und LNPs bestehen, messen diese Clowns wieder nur den apparenten pKa der LNP-Oberfläche mittels TNS-Assay.

Quote:

"This mechanistic rationale is empirically supported by our hemolysis data, where FL0445/DOPE-LNPs exhibited significantly higher membrane-disruptive activity at endosomal pH compared with DSPC-based benchmarks (Figure S5). Furthermore, while SM-102 and ALC-0315 also feature branched structures, the asymmetric and multi-branched nature of FL0445 provides a unique degree of “internal flexibility” or fluid-like environment within the LNP core. This allows the platform to adaptively encapsulate diverse nucleic acid topologies—ranging from rigid, high-molecular-weight Cap-cirRNA (Figures 7 and 8) to short, flexible ASOs (Figure 9)—a versatility not typically observed with more rigid or symmetric lipid scaffolds."

Die Formulierung „membrane-disruptive activity“ bzw. daraus abgeleitet „robust endosomal escape“ suggeriert eine mechanistische Aussage, die ein Hemolyse-Assay überhaupt nicht leisten kann:

Dieses Essay kann zeigen, ob
die Exposition von Erythrozyten gegenüber dem LNP unter diesen Bedingungen zu einer hinreichenden Membranschädigung führt, dass Hämoglobin freigesetzt wird?
Das ist ein Endpunkt für Membranintegritätsverlust.
Das ist nicht dasselbe wie: Wie verändert das LNP die physikalischen Eigenschaften einer Membran, sodass diese für einen transienten Translokations-/Fusion-/Permeabilitätsprozess empfänglich wird?

Membran–LNP-Interaktions-Kette und nichts davon wurde exkludiert, außer das Ende, was nicht zwingend sein muss, wenn nicht die passenden Threshholds überschritten wurden für die totale Membran Disruption: Ladungsumverteilung → Änderung der lateralen Organisation
→ Lipid-Domänen-/Cluster-Reorganisation → Änderung der Packungsdichte → Änderung von Krümmungsstress / Biegemodul / Membranspannung→ lokale Defekte / transient erhöhte Permeabilität → Fusion/Hemifusion/Leakage → irreversible Membranschädigung → Lyse / Zelltod

Der Hemolyse-Assay sitzt praktisch ganz am Ende dieser Kette.*

*Dimitrov JD, Roumenina LT, Perrella G, Rayes J. Basic Mechanisms of Hemolysis-Associated Thrombo-Inflammation and Immune Dysregulation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2023;43(8):1349-1361. doi:10.1161/ATVBAHA.123.318780

Sæbø IP, Bjørås M, Franzyk H, Helgesen E, Booth JA. Optimization of the Hemolysis Assay for the Assessment of Cytotoxicity. Int J Mol Sci. 2023 Feb 2;24(3):2914. doi: 10.3390/ijms24032914. PMID: 36769243; PMCID: PMC9917735.

Van Buren T, Arwatz G, Smits AJ. A simple method to monitor hemolysis in real time. Sci Rep. 2020 Mar 20;10(1):5101. doi: 10.1038/s41598-020-62041-8. PMID: 32198369; PMCID: PMC7083869.

Das eigentliche Problem dieser Arbeit liegt nicht darin, dass die verwendeten Safety Assays an sich schlecht wären, sondern darin, dass aus ihren Ergebnissen eine mechanistische und sicherheitsbezogene Aussage abgeleitet wird, die diese Messungen überhaupt nicht tragen. Gemessen werden im Wesentlichen akute Serumzytokine wie IL 6, TNF α, IFN β und IFN γ, die Lebermarker ALT und AST, Körpergewicht und einige weitere Serumparameter nach einer einzelnen beziehungsweise kurzfristig beobachteten Exposition. Damit kann man durchaus sagen, dass FL0445 unter den getesteten Bedingungen gegenüber bestimmten Vergleichs LNPs eine geringere akute inflammatorische Reaktion und weniger offensichtliche akute systemische Toxizitätszeichen hervorgerufen hat. Daraus lässt sich aber weder eine umfassende Sicherheit noch die behauptete physikochemische Grundlage dieser Sicherheit ableiten. Genau das ist besonders problematisch, weil die Autoren ihre Sicherheitsergebnisse mit einer mechanistischen Geschichte über die besondere innere Architektur von FL0445, veränderte Lipidpackung, geringere Membranspannung, Membraninteraktionen und eine besondere intrazelluläre Verarbeitung verknüpfen. Keine der verwendeten Safety Messungen untersucht jedoch die dafür entscheidende Ebene der Zellmembran. Es wird nicht bestimmt, wie FL0445 mit dem gesamten Plasmamembran Bilayer interagiert, ob sich lokale Packungsdichte, Membranordnung, Oberflächenladung, laterale Lipiddomänen, Cholesterinorganisation, Phosphoinositidverteilung, Membrankrümmung oder die Kopplung zwischen Membran und Zytoskelett verändern. Ebenso wenig wird untersucht, ob solche Veränderungen die räumliche Organisation von Membranproteinen, Rezeptoren oder Signalplattformen beeinflussen und damit bereits an der Zelloberfläche die nachfolgende Aufnahme und zelluläre Verarbeitung verändern. Der Hemolyse Assay liefert hierzu ebenfalls keine mechanistische Antwort. Er zeigt lediglich, dass unter den verwendeten Bedingungen eine stärkere Schädigung der Erythrozytenmembran auftritt. Eine solche irreversible Membranschädigung ist aber etwas völlig anderes als eine reversible oder subletale physikochemische Reorganisation eines Zellmembran Bilayers, die beispielsweise Packung, Ladung, Domänenorganisation oder Signalverarbeitung verändern könnte. Gerade eine solche nichtlytische Membranreorganisation wäre für das Verständnis der LNP Zell Interaktion wesentlich interessanter als die Frage, ab wann eine Modellmembran schlicht ihre Integrität verliert. Auch die stärkere Abhängigkeit der Aufnahme von Cholesterin nach MβCD Behandlung beweist keinen bestimmten endozytotischen Weg, weil die Entfernung von Cholesterin die physikalischen Eigenschaften und die Organisation der gesamten Plasmamembran verändert. Damit kann der Assay ebenso gut eine veränderte Abhängigkeit der LNP Membraninteraktion von der physikalischen Organisation des Zellmembran Bilayers anzeigen. Die Arbeit misst also überwiegend nachgeschaltete Phänotypen und interpretiert diese anschließend als Beleg für eine bestimmte physikochemische Mechanik, ohne die entscheidenden Zwischenebenen tatsächlich zu messen. Das gilt auch für die Sicherheit. Weniger IL 6 oder TNF α bedeutet nicht, dass keine relevante Membranperturbation, kein zellulärer Stress, keine Veränderung der Membranhomöostase und keine anderen subklinischen Effekte stattfinden. ALT und AST zeigen ebenfalls nur bestimmte Aspekte akuter Leberschädigung und Körpergewicht ist ein extrem grober systemischer Endpunkt. Schon gar nicht lässt sich aus einer solchen kurzfristigen Einmalgabe die Sicherheit einer Plattform für wiederholte Anwendung bei chronischen Erkrankungen ableiten. Die Daten belegen daher durchaus eine interessante akute Verträglichkeit unter den konkret getesteten Bedingungen, aber sie belegen weder die behauptete physikochemische Ursache dieser Verträglichkeit noch eine umfassende Sicherheit. Genau darin liegt meines Erachtens der PR Charakter der Arbeit: Aus einigen real gemessenen, durchaus interessanten Phänotypen wird eine geschlossene Geschichte über innere LNP Architektur, Zellmembraninteraktion, intrazelluläres Routing, Endosomenverarbeitung, Transfektion und Sicherheit konstruiert, obwohl die entscheidenden physikalischen Übergänge zwischen diesen Ebenen weitgehend gar nicht gemessen/ demonstriert wurden.